Múltiples ATPasas ParA/MinD coordinan el posicionamiento de cargas dispares en una célula bacteriana

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3255 (2023) Citar este artículo

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En los eucariotas, las proteínas motoras lineales gobiernan el transporte y la organización intracelular. En las bacterias, donde los motores lineales involucrados en la regulación espacial están ausentes, la familia de ATPasas ParA/MinD organiza una serie de cargas celulares basadas en genes y proteínas. El posicionamiento de estos cargos se ha investigado de forma independiente en diversos grados en varias especies bacterianas. Sin embargo, no está claro cómo múltiples ATPasas ParA/MinD pueden coordinar el posicionamiento de diversas cargas en la misma celda. Aquí, encontramos que más de un tercio de los genomas bacterianos secuenciados codifican múltiples ATPasas ParA/MinD. Identificamos un organismo (Halothiobacillus neapolitanus) con siete ATPasas ParA/MinD, demostramos que cinco de ellas están dedicadas a la regulación espacial de una sola carga celular y definimos los determinantes de especificidad potenciales para cada sistema. Además, mostramos cómo estas reacciones de posicionamiento pueden influirse entre sí, destacando la importancia de comprender cómo se coordinan el tráfico de orgánulos, la segregación cromosómica y la división celular en las células bacterianas. Juntos, nuestros datos muestran cómo coexisten y funcionan múltiples ATPasas ParA/MinD para posicionar un conjunto diverso de cargas fundamentales en la misma célula bacteriana.

Los filamentos de actina, los microtúbulos y las proteínas motoras lineales que los recorren son bien conocidos por su organización espacial en las células eucariotas. Sin embargo, en las bacterias, donde los motores lineales involucrados en el posicionamiento están ausentes, una amplia familia de ATPasas ParA/MinD (A/D) organiza espacialmente plásmidos, cromosomas y una variedad de orgánulos basados ​​en proteínas, muchos de los cuales son fundamentales para la supervivencia celular. y patogénesis. Con mucho, las dos ATPasas mejor estudiadas, y del mismo nombre familiar, son ParA involucrada en la partición de plásmidos y la segregación de cromosomas1,2, y MinD involucrada en el posicionamiento de divisomas3. Menos estudiada es la creciente lista de ATPasas A/D, generalizadas en los procariotas, involucradas en la regulación espacial de diversos orgánulos basados ​​en proteínas, como microcompartimentos bacterianos (BMC)4,5, flagelos6,7, grupos de quimiotaxis8,9 y maquinaria de conjugación10.

A pesar de que las cargas son tan diversas, las ATPasas A/D comparten una serie de características: (i) todas forman dímeros de sándwich ATP11, (ii) la dimerización forma una interfaz para unir una matriz de posicionamiento: el nucleoide para ATPasas similares a ParA12,13 o la membrana interna para ATPasas similares a MinD14,15, y (iii) la dimerización también forma un sitio de unión para una proteína asociada afín que conecta una ATPasa a su carga y estimula su liberación desde la matriz de posicionamiento. Por ejemplo, en la segregación cromosómica, la pareja de ParA es ParB, que se carga en un sitio similar a un centrómero, llamado parS, para formar un complejo masivo en el cromosoma cerca del origen de la replicación (OriC)2. Este complejo ParB-parS estimula localmente la actividad ParA ATPasa y la liberación de nucleoide, lo que genera gradientes de ParA en el nucleoide. La segregación de los cromosomas hermanos se produce cuando el complejo ParB-parS persigue gradientes de ParA unidos a nucleoides en direcciones opuestas16. Por lo tanto, a diferencia del aparato de huso mitótico utilizado en la segregación de cromosomas eucarióticos, los procariotas utilizan un modo fundamentalmente diferente de organización espacial: las ATPasas A/D generan ondas en las superficies biológicas para colocar sus respectivas cargas.

La segregación de cromosomas, el posicionamiento de la división celular y las reacciones de tráfico de orgánulos se han investigado de forma independiente en diversos grados en varios procariotas. Sin embargo, aún se desconoce cuántas A/D ATPasas se pueden codificar en una sola bacteria para posicionar múltiples cargas dispares, o cómo las bacterias coordinan espaciotemporalmente el posicionamiento de un conjunto tan diverso de cargas fundamentales en la misma célula. Además, las variaciones mecánicas y los determinantes de especificidad que rigen el posicionamiento de un conjunto tan diverso de carga celular siguen sin estar claros. Esto se debe a que las reacciones de posicionamiento basadas en A/D normalmente se estudian independientemente unas de otras y en bacterias modelo con pocas ATPasas A/D.

Aquí, encontramos que un tercio de las bacterias secuenciadas codifican múltiples ATPasas A/D. Entre estas bacterias, identificamos Halothiobacillus neapolitanus (H. neapolitanus en lo sucesivo), con siete ATPasas A/D putativas. El análisis de vecindad de los genes A/D ATPasa en H. neapolitanus implica varias cargas putativas. Usamos genética y biología celular para asignar cinco de las ATPasas A/D en H. neapolitanus a sus cargas. Nuestros hallazgos muestran que cada ATPasa está directamente dedicada al posicionamiento y herencia fiel de un tipo de carga específico. La manejabilidad y el número de ATPasas A/D hicieron de H. neapolitanus una herramienta valiosa para investigar también cómo las bacterias coordinan los procesos de segregación de cromosomas y división celular con el tráfico de orgánulos, una cuestión bien estudiada en las células eucariotas que sigue sin resolverse en las procariotas. Mostramos cómo la eliminación de una ATPasa A/D puede tener efectos indirectos en la herencia de cargas dispares posicionadas por otras ATPasas A/D a través de defectos en la replicación del ADN, la segregación cromosómica y/o la división celular. También proporcionamos evidencia de que el posicionamiento de los flagelos influye en la regulación espacial de los grupos de quimiotaxis. Finalmente, identificamos determinantes estructurales y de secuencia putativos que vinculan de manera única cada ATPasa A/D a una carga específica, lo que finalmente permite que estas ATPasas relacionadas coexistan y funcionen en la misma célula. Juntos, nuestro estudio investiga la similitud mecánica y la variación en la familia de ATPasa más extendida utilizada en la regulación espacial de diversas cargas celulares en procariotas, y todo dentro de una sola célula.

No está claro cuántas ATPasas de la familia ParA/MinD (A/D) están codificadas en un solo organismo. Para responder a esta pregunta, realizamos un extenso análisis tBLASTn usando una secuencia de proteína de consenso, generada a partir de ATPasas A/D bien estudiadas, como consulta (ver métodos). Como ya se estableció17, encontramos que ~ 96 % de las bacterias de la base de datos de la secuencia de referencia del NCBI (RefSeq) codifican al menos una ATPasa A/D (datos complementarios 1 y 2). Estos hits se agruparon por especies bacterianas, que luego se ordenaron por el número de hits A/D. A partir de esta lista inicial, encontramos muchos genomas bacterianos que codifican de 10 a 20 ATPasas A/D. Sin embargo, estas bacterias con la mayor cantidad de ATPasas A/D tenían sus genomas codificados en múltiples plásmidos y cromosomas, cada uno de los cuales codifica su propio sistema de segregación de ADN basado en ParA18. Para este estudio, nos enfocamos específicamente en comprender cómo coexisten múltiples ATPasas A/D y coordinan el posicionamiento de cargas dispares en la misma celda. Por lo tanto, filtramos aún más nuestro conjunto de datos para identificar bacterias que codifican múltiples ATPasas A/D, pero solo un cromosoma y ningún plásmido estable (Datos complementarios 1 y 2). Incluso después de tener en cuenta las bacterias con genomas codificados en múltiples elementos genéticos, nuestro análisis bioinformático reveló que más de un tercio de las bacterias secuenciadas codifican múltiples ATPasas A/D (Fig. 1a, Datos complementarios 1 y 2).

el 96% de los genomas bacterianos secuenciados codifican al menos una ATPasa A/D y el 35% codifica múltiples. Cada pico representa una especie bacteriana y la longitud del pico indica el número de aciertos A/D únicos por bacteria. b H. neapolitanus codifica siete supuestos sistemas de posicionamiento similares a ParA/MinD. El análisis de vecindad de genes implica las cargas putativas asociadas con cada ATPasa A/D putativa. c La alineación de secuencias múltiples de cada ATPasa A/D de H. neapolitanus contra miembros de la familia ParA/MinD verificados experimentalmente implica aún más las cargas putativas identificadas por el análisis de vecindad de genes. Cada una de las ATPasas A/D putativas en H. neapolitanus se agrupa con miembros de la familia que se muestra que colocan las cargas celulares indicadas (naranja) en otras bacterias.

A continuación, nos dispusimos a determinar cómo múltiples A/D ATPasas pueden coexistir en la misma celda para colocar cargas dispares. Para abordar esta pregunta, identificamos un organismo de nuestra lista de bacterias que codifican múltiples ATPasas A/D (datos complementarios 1 y 2). Entre el 1 % superior de bacterias (que codifican seis o más A/D ATPasas), identificamos varios patógenos, incluidos Clostridia, Burkholderia, Mycobacteria, Vibrio, Pseudomonas y Xanthomonas. También identificamos el organismo no patógeno y manejable experimentalmente, H. neapolitanus, un quimioautótrofo oxidante de azufre de crecimiento lento que codifica siete ATPasas A/D putativas en un cromosoma (Fig. 1b). La regulación espacial por A/D ATPasas se ha estudiado en gran medida en bacterias modelo de rápido crecimiento. Elegimos intencionalmente una bacteria de crecimiento lento (tiempo de duplicación de 6 h) porque los eventos poco frecuentes de segregación de ADN y división celular permitieron ventanas de observación más grandes y una visión más directa de la dinámica del tráfico de orgánulos. La manejabilidad, la tasa de crecimiento lento y la abundancia de ATPasas A/D hicieron de H. neapolitanus una opción ideal para estudios posteriores.

Para determinar si los hits de ATPasa A / D en H. neapolitanus eran de hecho reguladores espaciales, realizamos un análisis de vecindad de genes (GNA) para identificar cargas putativas (Fig. 1b). GNA nos permite inferir la función porque los genes A/D ATPasa a menudo se codifican cerca de los loci asociados a la carga. Por ejemplo, el sistema de segregación cromosómica ParABS normalmente se codifica cerca de OriC19. Sorprendentemente, las supuestas cargas que identificamos usando este enfoque incluyen el cromosoma y todas las cargas conocidas basadas en proteínas de la familia A/D ATPasa20,21. Si bien la regulación espacial de estas diversas cargas se ha estudiado individualmente en muchas bacterias modelo diferentes, su posicionamiento coordinado por múltiples ATPasas A/D nunca se ha investigado juntas en un organismo.

Como segunda línea de evidencia bioinformática que relaciona cada ATPasa A/D con una carga específica, investigamos la conservación de los vecindarios de genes de ATPasa A/D utilizando el análisis FlaGs (Flanking Genes)22. El análisis FlaGs predice asociaciones funcionales tomando una lista de accesiones de proteínas NCBI como entrada y agrupa proteínas codificadas por vecindad en grupos homólogos. Los homólogos de cada ATPasa A / D en H. neapolitanus se identificaron utilizando BLASTp, y los principales éxitos se usaron como entrada para el análisis de FlaG (Fig. 1 complementaria). El análisis muestra una fuerte conservación de los vecindarios del gen A/D ATPasa en múltiples filos bacterianos, lo que implica aún más las cargas putativas. Debido a los datos limitados sobre las ATPasas A/D asociadas con la conjugación10 o el metabolismo del nitrógeno, excluimos estos resultados de una mayor investigación en este estudio.

Con las cinco ATPasas A / D restantes, realizamos una alineación de secuencia múltiple contra los miembros de la familia ParA / MinD que se establecieron previamente para colocar una carga celular (Fig. 1c). Cada ATPasa A/D en H. neapolitanus se agrupó con un miembro de la familia específico que se sabe que coloca una carga celular específica en otras bacterias: el cromosoma (ParA2), el divisoma (MinD23), el carboxisoma (McdA4,5), el flagelo (FlhG6 ,7) y el grupo de quimiotaxis (ParC8,9). Estos datos proporcionan una tercera línea de evidencia que implica aún más los supuestos cargos identificados por nuestro GNA. A continuación, buscamos identificar directamente el papel de cada ATPasa A/D en el posicionamiento de las cargas implicadas por la bioinformática.

La segregación de cromosomas antes de la división celular es fundamental para la supervivencia celular. En la mayoría de las bacterias, la segregación cromosómica fiel y la herencia están mediadas por un sistema ParAB codificado cerca de OriC19. Sin ParAB, el ADN se hereda de forma asimétrica, lo que da como resultado células anucleadas y poliploides, y una aptitud celular reducida o muerte2. En H. neapolitanus, hay un sistema parAB putativo codificado cerca de OriC (Fig. 2a). Para obtener imágenes de la segregación cromosómica, el homólogo de ParB, codificado aguas abajo del gen parA putativo (Hn2335), se fusionó con la proteína fluorescente monomérica Neon Green (mNG). ParB-mNG se observó como uno o dos puntos por célula (Fig. 2b). El análisis de población mostró que las celdas más cortas tenían un solo foco en la mitad de la celda, mientras que las celdas más largas tenían dos focos en las posiciones cuartas de la celda (Fig. 2b). Cuando se eliminó el gen parA putativo (Hn2335), los focos ParB-mNG estaban completamente ausentes en el 25% de las células (Fig. 2d complementaria). Cuando los focos ParB estaban presentes, se colocaron aleatoriamente independientemente de la longitud de la celda (Fig. 2c) y significativamente más brillantes en comparación con las células WT (de tipo salvaje) (Fig. 2e complementaria). La complementación con Hn2335 en un locus exógeno restauró el posicionamiento de los focos (Fig. 2h complementaria). Estos datos sugieren que los cromosomas replicados en ∆Hn2335 ya no se segregaron fielmente, dando como resultado células anucleadas y poliploides.

Se requiere a–d Hn2335 para la segregación cromosómica. un Hn2335 se encuentra cerca de OriC y tiene un homólogo de ParB codificado aguas abajo. b, c La región de origen del cromosoma se marcó marcando el homólogo de ParB. Rojo claro: 1 foco/celda; rojo oscuro: 2 focos/célula. Las celdas WT cortas tenían un solo foco en la mitad de la celda, mientras que las celdas más largas tenían dos focos en las posiciones cuartas. Las células ΔHn2335 mostraron un posicionamiento aleatorio de focos ParB independientemente de la longitud de la celda. d Los diagramas de dibujos animados representan la segregación cromosómica en células WT y ΔHn2335. Se requiere e-h Hn1364 para el posicionamiento de divisomas. e Hn1364 se encuentra aguas arriba de minE. f, g El posicionamiento del divisoma se determinó por la ubicación de los sitios de constricción. Cada punto en el gráfico de densidad representa un sitio de constricción identificado. En las células WT, los sitios de constricción estaban en la mitad de la célula. En ΔHn1364, se encontraron sitios de constricción a lo largo de la longitud de la celda. h Los diagramas de dibujos animados representan la división celular en células WT y ΔHn1364. i–l El posicionamiento del carboxisoma está determinado por McdA. i Hn0912 (mcdA) se encuentra cerca de genes que codifican proteínas de cubierta de carboxisoma y Rubisco. j, k Los carboxisomas se visualizaron marcando la subunidad pequeña de la enzima Rubisco, cbbS. Cada punto en el gráfico de densidad representa un foco de carboxisoma. En las células WT, los carboxisomas se distribuyen a lo largo de la longitud de la célula. En ΔmcdA, los carboxisomas formaron grandes focos polares en uno o ambos polos. l Los diagramas de dibujos animados representan la distribución de carboxisomas en células WT y ΔHn0912. Se requiere m–p Hn0716 para regular la posición de los flagelos y el número de copias. m Hn0716 se encuentra cerca de genes asociados a flagelos. n, o La localización de flagelos se visualizó marcando un componente del cuerpo basal flagelar, fliN. Cada punto en el gráfico de densidad representa un foco FliN. Las células WT tenían un único foco FliN polar. En las células ΔHn0716, los focos de FliN se colocaron de forma más aleatoria a lo largo de la longitud de la célula. p Los diagramas de dibujos animados representan la localización y el número de flagelos en las células WT y ΔHn0716.q–t Se requiere Hn0722 para el posicionamiento del grupo de quimiotaxis. q Hn0722 se encuentra cerca de los genes asociados a la quimiotaxis. Los grupos de quimiotaxis r, s se visualizaron etiquetando el regulador de respuesta, cheY. Cada punto en el gráfico de densidad representa un foco CheY. Las células WT tenían un solo foco polar CheY. Las células mutantes ΔHn0722 típicamente no tenían focos CheY. t Los diagramas de dibujos animados representan grupos de quimiotaxis en células WT y ΔHn0722. (Todas las imágenes) Las micrografías que se muestran son imágenes representativas de al menos 3 experimentos. Barra de escala: 2 μm. (Todos los gráficos) Las células se analizaron y cuantificaron usando MicrobeJ. En el eje y, las celdas se ordenan aumentando su longitud, con celdas más cortas en la parte superior y celdas más largas en la parte inferior. El eje x representa la distancia desde la mitad de la celda en micrones; la línea vertical central equivale a una distancia de cero desde la mitad de la celda. Cada punto representa dónde se encontró un foco a lo largo de la celda. Para todos los gráficos de densidad, los colores más claros representan una densidad más alta, los colores más oscuros representan una densidad más baja. Para los gráficos de flagelos, quimiotaxis y carboxisomas, el polo celular más cercano a un foco se orientó hacia la izquierda; los focos en la mitad derecha del gráfico indican la presencia de un segundo foco. Ejes de gráficos para mutantes marcados con cromosomas, carboxisomas, flagelos y quimiotaxis: rango del eje y (longitud de la celda): 0,8–2,1 μm; rango del eje x (distancia desde la mitad de la celda): −1.1–1.1 μm. El eje X de las células ΔflhG es de 0,5 a 1,8 μm. Ejes gráficos para divisoma: rango del eje y (longitud de celda): 1.5–3.0 μm; rango del eje x (distancia desde la mitad de la celda): −1.5–1.5 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego realizamos microscopía de lapso de tiempo de focos de ParB-mNG y nucleoides teñidos con SYTOX para observar la segregación cromosómica en tiempo real. Las células WT recién nacidas tienen un solo foco ParB en la mitad de la célula, que luego se divide en dos focos que se segregan bidireccionalmente hacia las posiciones cuartas de la célula en crecimiento (Figura complementaria 2f y Película complementaria 1A). Se mantuvo el posicionamiento de los focos en los cuartos de celda, que luego se convirtió en la posición de mitad de celda de cada celda hija después de la división. La herencia y la segregación cromosómica fieles se perdieron cuando se eliminó el gen parA putativo (Hn2335) (Fig. 2g complementaria y Película complementaria 1B). Muchas células tenían un único foco ParB grande en un polo celular que no se dividía y todo el ADN se concentraba en una única célula hija tras la división. Estas hijas poliploides continuaron dividiéndose, mientras que las hijas anucleadas ya no eran viables. Estos datos confirmaron que el aumento de la intensidad de los focos de ParB en el mutante por deleción representa un aumento en el número de copias cromosómicas en estas células. En resumen, la ATPasa A/D codificada por Hn2335 es necesaria para una segregación cromosómica fiel (Fig. 2d) y en adelante nos referiremos a esta proteína como ParA.

El posicionamiento adecuado del divisoma asegura que cuando una célula se divide, ambas células hijas tienen aproximadamente la misma longitud. Sin el sistema Min, la división ocurre en cualquier región libre de nucleoide24, produciendo minicélulas anucleadas, los productos de las divisiones polares. Nuestros análisis bioinformáticos mostraron que la proteína codificada por Hn1364 es un homólogo de MinD, e inmediatamente después de este gen en el mismo operón hay un gen que codifica un homólogo de MinE (Fig. 2e). Para determinar si Hn1364 estaba realmente involucrado en el posicionamiento del divisoma, analizamos las células en división e identificamos sus sitios de constricción en relación con la longitud de la célula (Fig. 2f, g). Las células WT se dividieron cerca de la mitad de la celda (Fig. 2f y Fig. 3d complementaria) mientras que las células ΔHn1364 se dividieron asimétricamente (Fig. 2g y Fig. 3e complementaria). El análisis de población de células en división identificó sitios de constricción de células intermedias en el 97 % de las células WT en comparación con solo el 41 % de las células ΔHn1364 (Fig. 3f complementaria y Película complementaria 2). Además de los eventos de división asimétrica única, el 9% de las células en división en la población mutante ΔHn1364 formó múltiples sitios de división simultáneamente a lo largo de la longitud de la célula (Figura complementaria 3e, Figura complementaria 3g y Película complementaria 2C). Las divisiones desiguales dieron como resultado una mayor variación en la longitud de la celda (Fig. 3h complementaria). La complementación con Hn1364 en un locus exógeno restauró la constricción de la mitad de la célula y los eventos de división única (Fig. 3j complementaria). En general, nuestros hallazgos muestran que Hn1364 es fundamental para posicionar el divisoma en la mitad de la célula (Fig. 2h) y en adelante nos referiremos a esta proteína como MinD.

Los microcompartimentos bacterianos, o BMC, son grandes orgánulos icosaédricos basados ​​en proteínas que encapsulan reacciones metabólicas sensibles para proporcionar a los procariotas distintas ventajas de crecimiento25. A pesar de su importancia, se sabe poco sobre cómo se regulan espacialmente los BMC. El modelo BMC es el carboxisoma fijador de carbono que se encuentra en cianobacterias y proteobacterias26. Recientemente se descubrió que una ATPasa A / D, que denominamos Mantenimiento de la proteína A de distribución de carboxisoma (McdA), está muy extendida entre las bacterias que contienen carboxisoma, incluida H. neapolitanus (Fig. 2i) 4. McdA espacia carboxisomas en el nucleoide junto con su proteína asociada, McdB27,28. Para demostrar su requerimiento para el posicionamiento de carboxisomas, visualizamos carboxisomas marcando la subunidad pequeña de la enzima Rubisco encapsulada (cbbS) con mTurquoise2 para formar CbbS-mTQ. Como se mostró anteriormente, en las células WT, los carboxisomas se distribuyen a lo largo de la celda (Fig. 2j, Fig. 4d complementaria). En el mutante de deleción (ΔmcdA), los agregados de carboxisoma forman un gran foco polar brillante en uno u ocasionalmente en ambos polos (Fig. 2k, Fig. 4d complementaria, e). La complementación con mcdAB en un locus exógeno restauró el posicionamiento del carboxisoma (Fig. 4h complementaria). Estos datos son consistentes con nuestras observaciones previas usando TEM, que mostraron que los focos en la población mutante representan una agregación de carboxisomas28 ensamblados.

Ampliamos nuestros hallazgos anteriores aquí con microscopía de lapso de tiempo a largo plazo. En las células WT, los carboxisomas se posicionan dinámicamente a lo largo de la longitud de la célula a lo largo de múltiples generaciones (Fig. 4f complementaria y Película complementaria 3A). En el mutante de deleción, los agregados de carboxisoma polar estaban estancados (Fig. 4g complementaria y Película complementaria 3B). Juntos, nuestros hallazgos muestran que la ATPasa A / D codificada dentro del operón del carboxisoma, que denominamos McdA, es esencial para distribuir los carboxisomas a lo largo de la célula y garantizar la homeostasis de los orgánulos después de la división (Fig. 2l).

Los flagelos son estructuras filamentosas externas que permiten la motilidad bacteriana. Las bacterias varían en la ubicación, el número y el patrón de los flagelos. Muchas bacterias codifican una ATPasa A/D llamada FlhG en su operón flagelar, que es esencial para diversos patrones de flagelación en muchas bacterias7, aunque los mecanismos siguen sin estar claros (discusión complementaria). En los flagelados polares, la supresión de flhG suele dar lugar a cambios en el número y la motilidad de los flagelos6,29,30,31,32,33,34. Mientras tanto, en el organismo peritrichous, Bacillus subtilis, la eliminación de flhG da como resultado cambios en la ubicación de los flagelos35. Sorprendentemente, la deleción de flhG en el organismo anfítrico, Campylobacter jejuni, también produce defectos en la división celular36,37.

Nuestro análisis bioinformático sugiere que Hn0716 dentro del operón de flagelos codifica un homólogo de FlhG (ver Fig. 1c). Para determinar si Hn0716 está involucrado en la regulación espacial flagelar, primero visualizamos una fusión mNG de FliN, que es un componente del cuerpo basal flagelar que se ensambla en la cara citoplasmática de la membrana (Fig. 2m)38. Las células WT tenían un solo foco mNG-FliN en el polo celular extremo (Fig. 2n). En las células ΔHn0716, los focos FliN ya no estaban posicionados fielmente (Fig. 2o) y era más probable que las células tuvieran cero o múltiples focos (Fig. 5d complementaria). La complementación con Hn0716 en un locus exógeno restauró la localización de los focos FliN en los polos (Fig. 5i complementaria). Estos datos sugieren que se requiere Hn0716 para colocar un solo flagelo en un solo polo en H. neapolitanus.

A continuación, nos dispusimos a determinar si estas alteraciones en el posicionamiento de FliN afectaban la motilidad celular. Los ensayos de motilidad en agar blando encontraron que las células ΔHn0716 no eran móviles (Fig. 5g complementaria). La pérdida de motilidad puede deberse a una mala posición de los flagelos, pérdida de flagelos o hiperflagelación. Para obtener imágenes de flagelos, diseñamos flagellinT185C, que permite el etiquetado fluorescente de flagelos mediante la adición de una tinción de maleimida reactiva con cisteína a los medios39. Descubrimos que las células WT H. neapolitanus son monotrichous, con un solo flagelo polar que emana del foco FliN (Suplementario. Fig. 5h). Las células ΔHn0716 también tenían flagelos que emanaban de focos FliN, sin embargo, las células estaban hiperflageladas, con múltiples flagelos a menudo agrupados como mechones, que emanaban de varios focos FliN. Concluimos que se requiere Hn0716 para regular el número y la posición de los flagelos en H. neapolitanus (Fig. 2p) y en adelante nos referiremos a esta proteína como FlhG. Los estudios futuros investigarán los efectos pleiotrópicos únicos de flhG en el ensamblaje, el número y la ubicación de los flagelos, así como en la división celular en H. neapolitanus (Discusión complementaria).

Dirigiendo la motilidad bacteriana hay grandes conjuntos hexagonales llamados grupos de quimiotaxis, compuestos por quimiorreceptores, una proteína adaptadora (CheW) y una quinasa (CheA). Han evolucionado varios mecanismos para controlar tanto el número como el posicionamiento de los grupos de quimiotaxis, incluido el uso de ATPasas A/D (llamadas ParC en especies de Vibrio o PpfA en R. sphaeroides). En las especies de Vibrio, ParC dirige las matrices de quimiotaxis a una proteína de referencia polar llamada HubP8,40. Como consecuencia, las células hijas heredan una matriz en su polo anterior tras la división celular. En R. sphaeroides, no hay puntos de referencia polares y PpfA distribuye grupos de quimiotaxis sobre el nucleoide9,41. Cuando se estudió, la eliminación de la ATPasa A/D altera el número de grupos de quimiotaxis y el posicionamiento en las células, lo que da como resultado una reducción en la motilidad de propagación en agar blando.

Nuestro análisis bioinformático mostró que la proteína codificada por Hn0722 es un homólogo de ParC/PpfA dentro del operón de quimiotaxis de H. neapolitanus (ver Fig. 1c). Para determinar si Hn0722 es importante para la regulación espacial de los grupos de quimiotaxis, primero tomamos imágenes de los grupos de quimiotaxis fusionando mNG con CheY (Fig. 2q). CheY es un regulador de respuesta que es fosforilado por CheA y se ha demostrado previamente que se colocaliza con grupos de quimiotaxis en E. coli42,43. De acuerdo con las micrografías electrónicas de grupos de quimiotaxis en H. neapolitanus44, CheY-mNG formó un solo foco inmediatamente proximal a un polo celular en ~ 85% de las células WT (Fig. 2r, Fig. 6d complementaria). Sin embargo, cuando se eliminó Hn0722, la señal de CheY-mNG fue difusa en ~ 80% de la población celular (Fig. 2s, Fig. 6d complementaria). En el ~ 20% de las células ΔHn0722 que tenían un foco CheY-mNG, los focos tenían una intensidad significativamente menor (Fig. 6e complementaria). La complementación con los genes superpuestos Hn0722 y Hn0723 recuperó focos CheY en los polos (Fig. 6f complementaria). Juntos, concluimos que se requiere Hn0722 para el ensamblaje y el posicionamiento del grupo de quimiotaxis en H. neapolitanus (Fig. 2t) y en lo sucesivo nos referiremos a esta proteína como ParC.

Hasta ahora, hemos proporcionado evidencia directa que muestra que cinco ATPasas A/D posicionan cinco cargos celulares dispares en H. neapolitanus (Fig. 2). A continuación, preguntamos si cada una de las cinco reacciones de posicionamiento se produjo de forma independiente. Para responder a esta pregunta, eliminamos individualmente cada ATPasa A/D en cada cepa de fondo marcada con carga (Fig. 3). Encontramos que el posicionamiento de carboxisoma (Fig. 3c) y flagelos (Fig. 3d) no se vio afectado en gran medida por la eliminación de ATPasas A / D distantes. Curiosamente, el posicionamiento del cromosoma (Fig. 3a), el divisoma (Fig. 3b) y el grupo de quimiotaxis (Fig. 3e) o la intensidad del foco se vieron influenciados en las células ΔflhG, aunque con fenotipos intermedios en comparación con la eliminación de la ATPasa A/D dedicada ( Fig. 3, recuadros en negrita). Juntos, nuestros datos muestran que cada ATPasa A/D está dedicada al posicionamiento de un tipo de carga específico y no está directamente involucrada en el posicionamiento de otras cargas. Sin embargo, nuestros datos a nivel de población celular también revelaron posibles coordinaciones, diafonías y/o interdependencias entre ciertas reacciones de posicionamiento. En las siguientes tres secciones, analizamos cómo el posicionamiento de la carga por una ATPasa A/D puede coordinarse indirectamente con el posicionamiento y la herencia de una carga posicionada por otra ATPasa A/D.

Cada una de las cinco cargas celulares se marcó con fluorescencia como se indica (izquierda): un cromosoma (ParB-mNG), b divisoma (sitio de invaginación), c carboxisomas (CbbS-mTQ), d flagelos (mNG-FliN) y e grupos de quimiotaxis (CheY-mNG). (Todas las imágenes) Las micrografías que se muestran son imágenes representativas de al menos 3 experimentos. Barra de escala: 2 μm. La columna "Solo etiqueta" muestra el posicionamiento WT de cada una de las cargas fluorescentes. La eliminación de una ATPasa A/D resultó en la localización incorrecta de solo su carga específica (rectángulos en negrita). Los gráficos en la columna "solo etiqueta" y los gráficos en los rectángulos en negrita están duplicados de la Fig. 2. Ejes de gráficos para mutantes marcados con cromosomas, carboxisomas, flagelos y quimiotaxis: rango del eje x (longitud de celda): 0.8–2.1 μm; rango del eje y (distancia desde la mitad de la celda): −1.1–1.1 μm. Todos los ejes x de las células ΔflhG son de 0,5 a 1,8 μm. Ejes gráficos para divisoma: rango del eje x (longitud de celda): 1.5–3.0 μm; rango del eje y (distancia desde la mitad de la celda): −1.5–1.5 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Hemos demostrado cómo la eliminación de parA da como resultado una fracción significativa de células anucleadas porque ParA se requiere directamente para la segregación cromosómica y la herencia después de la división celular (Fig. 4a). Eliminar minD o flhG también resultó en células anucleadas, pero el mecanismo fue diferente en cada caso. En las células ΔminD, el posicionamiento de los cromosomas (Fig. 4b) y las intensidades de los focos de ParB (Fig. 4c) fueron similares a las de WT, lo que muestra que la segregación cromosómica aún estaba activa. En cambio, fue el posicionamiento erróneo del divisoma en las células ΔminD y la subsiguiente división celular asimétrica (Fig. 4d) lo que indirectamente causó la herencia cromosómica asimétrica y la formación de células anucleadas.

a La eliminación de la ATPasa A/D requerida para el posicionamiento del cromosoma (parA), divisoma (minD) o flagelar (flhG) dio como resultado células anucleadas (recuadros grises). b Solo las células ΔparA tenían focos ParB mal colocados. Las celdas con un solo foco ParB son rojas. Las celdas con dos focos ParB son negras. Las células ΔflhG mantuvieron un solo foco ParB en células largas, lo que sugiere un defecto de replicación del ADN. c Los focos de ParB son más brillantes solo en las células ΔparA. WT: n = 1289; ∆parA: n = 773; ∆minD: n = 990; ∆flhG: n = 747 células biológicamente independientes. Valores p de Kruskal-Wallis: ∆parA: <0,0001; ∆minD: 0,97; ∆flhG: 1. d La eliminación de minD o flhG resultó en un posicionamiento erróneo del divisoma. Los sitios de constricción se consideraron "mitad de la celda" cuando se encontraron dentro del 5% del centro de la celda a lo largo del eje largo. WT: n = 6; ∆parA, ∆minD y ∆flhG: n = 5 muestras biológicamente independientes. Prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch Valores p: ∆parA: 0,28; ∆minD: <0,0001; ∆flhG: <0,0001 e La eliminación de flhG resultó en un efecto intermedio en el posicionamiento del divisoma en comparación con ΔminD. Cada punto en el gráfico de densidad representa un sitio de constricción identificado. Los colores más claros representan una mayor densidad, los colores más oscuros representan una menor densidad. Los paneles b y e se resumen en la Fig. 3. (Todas las imágenes) Barra de escala: 2 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En las células ΔflhG, el posicionamiento de los cromosomas (Fig. 4b) y las intensidades de los focos de ParB (Fig. 4c) también fueron similares a las de WT, lo que nuevamente sugiere que la segregación de los cromosomas no se vio afectada. Pero, el posicionamiento erróneo del divisoma no fue tan grave como el de las células ΔminD (Fig. 4d, e), lo que sugiere que las células anucleadas se estaban formando a través de un tercer mecanismo distinto. Curiosamente, las células ΔflhG tenían menos probabilidades de tener dos focos ParB en comparación con las células WT (Fig. 4a). En cambio, las células anteriores a la división todavía tenían un solo foco ParB (Fig. 4b) con intensidades que sugerían la presencia de una sola copia de cromosoma (Fig. 4c). La microscopía de lapso de tiempo confirmó que el posicionamiento de los focos ParB se mantuvo activamente (Película complementaria 4). Por lo tanto, es probable que las células ΔflhG anucleadas se formen debido a defectos en la replicación cromosómica y/o división celular prematura; una cuestión de estudio futuro.

Juntos, los hallazgos enfatizan la importancia de investigar las relaciones funcionales de las ATPasas A/D entre sí y con el ciclo celular bacteriano, cuando ocupan el mismo organismo.

McdA utiliza el nucleoide como matriz de posicionamiento para la distribución de carboxisomas27,28. Por lo tanto, fue sorprendente que en la población mutante ΔparA, todas las células anucleadas retuvieran carboxisomas (Fig. 5a). Para determinar si las células anucleadas sintetizaron carboxisomas de novo o si los carboxisomas se heredaron de alguna manera después de la división, realizamos microscopía de lapso de tiempo en células ΔparA con carboxisomas fluorescentes (Fig. 5b y Película complementaria 5A). Curiosamente, las células anucleadas heredaron carboxisomas, pero de la manera más inesperada. En la división de células ΔparA que no lograron dividir sus focos ParB, los carboxisomas en la célula anucleada se agruparon inmediatamente adyacentes al plano de división. La agrupación de carboxisomas coincidió con la acción de enrollamiento de cromosomas que se produjo en el tabique invaginante justo antes de la división completa y la herencia cromosómica asimétrica (consulte la Fig. 2g complementaria y la Película complementaria 1B). Después de que se completó la tabicación, el paquete de carboxisoma masivo se liberó explosivamente del nuevo polo de la célula anucleada, lo que resultó en múltiples focos de carboxisoma que se difundieron libremente (Fig. 5b y Película complementaria 5A). Las células anucleadas que albergaban carboxisomas no se dividieron más. Descubrimos que las células anucleadas en las poblaciones de células ΔminD (Fig. 5c y Película complementaria 5B) y ΔflhG (Fig. 5d y Película complementaria 5C) también heredaron carboxisomas a través del mismo mecanismo. Juntos, los datos muestran cómo el tráfico y la distribución de carboxisomas por parte de McdA dependen de una segregación cromosómica fiel. Sin embargo, las células anucleadas aún pueden heredar carboxisomas en las cepas con deleción parA, minD o flhG porque los carboxisomas se eliminan por raspado de los cromosomas mal segregados que se enrollan a través del sitio de invaginación durante la tabicación. Especulamos que todas las cargas de mesoescala que utilizan nucleoides asimétricamente heredados como matriz de posicionamiento mostrarían el mismo modo de herencia.

a Los carboxisomas están presentes en las células anucleadas (círculo discontinuo). Las micrografías que se muestran son imágenes representativas de 2 experimentos. b La microscopía de lapso de tiempo muestra que los carboxisomas (verde) en las células ΔparA están unidos al nucleoide, pero se heredan en las células anucleadas a través de la liberación del cromosoma extruido. Los carboxisomas también se heredan en células anucleadas c ΔminD y células anucleadas d ΔflhG a través del mismo mecanismo. (Todos los videos) Las flechas blancas resaltan la agrupación de carboxisomas y la posterior liberación. Barra de escala: 1 μm.

La ATPasa A/D que posiciona los grupos de quimiotaxis en Rhodobacter sphaeroides utiliza el nucleoide como su matriz de posicionamiento41. Por lo tanto, sospechamos que las eliminaciones de A/D ATPasa que dan como resultado células anucleadas afectarían indirectamente la regulación espacial de los grupos de quimiotaxis en estas cepas. De hecho, encontramos que las cepas de eliminación de parA, minD y flhG, todas las cuales forman células anucleadas (ver Fig. 4a), tenían un aumento correspondiente en las células que carecían de grupos de quimiotaxis (Fig. 6a), y cuando las células tenían focos, eran notablemente más tenue en comparación con WT (Fig. 6b).

La eliminación de parA, minD o flhG influye en la quimiotaxis agrupar un número (WT: n = 4, ∆parA: n = 4, ∆minD: n = 5, ∆mcdA: n = 4, ∆flhG: n = 4, ∆parC : n = 4 muestras biológicamente independientes Test ANOVA de Brown-Forsythe y Welch Valores p: ∆parA: 0,0013, ∆minD: 0,0642, ∆mcdA: 0,1141, ∆flhG: 0,0043, ∆parC: 0,0012) y b ensamblaje (n = 455 células biológicamente independientes Test de Kruskal-Wallis Valores p: ∆parA: <0,0001, ∆minD: <0,0001, ∆mcdA: 0,0171, ∆flhG: <0,0001, ∆parC: <0,0001). Solo la eliminación de flhG influyó sustancialmente en el número c de flagelos y en el ensamblaje d (n = 851 células biológicamente independientes. Valores de p de la prueba de Kruskal-Wallis: ∆parA: 0,1161, ∆minD: 0,4433, ∆mcdA: 0,0184, ∆flhG: <0,0001, ∆ parC: 0,0051). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Es importante tener en cuenta que, si bien las cepas ΔparA y ΔminD exhibieron efectos moderados en el ensamblaje del grupo de quimiotaxis, la eliminación de flhG fue más severa (Fig. 6a, b). Dado que los grupos de quimiotaxis se comunican con el flagelo para mover la bacteria hacia condiciones favorables, planteamos la hipótesis de que el ensamblaje y la organización del grupo de quimiotaxis en H. neapolitanus está regulado por el posicionamiento del flagelo. Curiosamente, este efecto no fue recíproco, ya que la eliminación de parC tuvo un efecto mínimo sobre el número de focos de flagelos (Fig. 6c) o la intensidad del cuerpo basal de flagelos (Fig. 6d). La identificación de los actores moleculares responsables de esta diafonía en la regulación espacial del grupo de flagelos y quimiotaxis es un tema de trabajo futuro. Juntos, nuestros datos demuestran interdependencias en la forma en que las ATPasas A/D coordinan el posicionamiento de los orgánulos basados ​​en proteínas entre sí, así como los procesos de segregación de ADN y división celular.

Hemos demostrado experimentalmente que múltiples A/D ATPasas coexisten y coordinan el posicionamiento de múltiples cargas dispares en la misma celda. También mostramos que el posicionamiento basado en A/D es específico de la carga. Se ha demostrado que las ATPasas A/D forman estructuras de dímero sándwich muy similares45,46,47,48, y las predicciones AlphaFold2 (AF2) sugieren que este también es el caso de las cinco ATPasas A/D de H. neapolitanus estudiadas aquí (Fig. 7a-b). Las similitudes estructurales sugieren que existen interfaces conservadas únicas para cada A/D ATPasa que brindan especificidad, vinculando una A/D ATPasa a su carga particular.

Utilizando las predicciones de AF2 y Rosetta, determinamos las estructuras A/D ATPasa de H. neapolitanus e identificamos las supuestas interfaces de interacción que brindan especificidad a cada reacción de posicionamiento. Hay tres interfaces en una ATPasa A/D que confieren especificidad: (1) la interfaz de dimerización, (2) la interfaz para la interacción con su matriz de posicionamiento (nucleoide o membrana) y (3) la interfaz para la interacción con su proteína asociada. , que finalmente vincula la ATPasa a su carga. Identificamos estas tres interfaces para las cinco ATPasas A / D en H. neapolitanus (Fig. 7) y predecimos los residuos clave necesarios para estas asociaciones (Datos complementarios 3).

Se generaron estructuras de homodímero de ATPasas A/D en H. neapolitanus utilizando AlphaFold2 (cian). Los residuos putativos para la especificidad del homodímero están resaltados en magenta. b Los dímeros de a están orientados sobre su matriz de posicionamiento: ADN nucleoide o membrana. Los residuos putativos críticos para unir el ADN nucleoide o la membrana están resaltados en rojo. c Estructuras de dímero acopladas con el péptido de interacción N-terminal de proteínas socias putativas (naranja), que confieren especificidad de carga. Recuadro ampliado: los residuos predichos críticos para esta asociación son cian lleno de espacios en la ATPasa y naranja en la proteína asociada.

La especificidad en la interfaz del dímero restringe las ATPasas A/D a la homodimerización y, por lo tanto, permite que cada ATPasa A/D funcione de forma independiente en la misma célula sin interferencia cruzada (Fig. 7a). Los residuos putativos necesarios para la homodimerización de las cinco ATPasas A/D en H. neapolitanus se proporcionan en Datos complementarios 3, Tab. 1.

Las ATPasas tipo ParA usan el nucleoide y las ATPasas tipo MinD usan la membrana interna para el posicionamiento de la carga. ParA, McdA y ParC tienen residuos básicos en sus extremos C para la unión no específica al ADN nucleoide, mientras que MinD y FlhG tienen secuencias de orientación a la membrana (MTS) para la unión a la membrana (Fig. 7b). Identificamos los residuos predichos necesarios para que cada ATPasa A/D se asocie con su matriz de posicionamiento respectiva (Datos complementarios 3, Pestaña 2).

La especificidad de la carga para las ATPasas A/D proviene de la interacción con una proteína asociada que se asocia con la carga o es un componente físico de la carga misma. Las proteínas asociadas tienen un tramo de aminoácidos enriquecidos en residuos cargados en el extremo N que interactúa exclusivamente con su ATPasa A/D, mientras que el resto de la proteína asociada se dedica a la asociación de carga49. Generamos modelos de acoplamiento de cada ATPasa A/D con un péptido N-terminal de su proteína asociada (Fig. 7c). Los péptidos se definieron como los primeros 30 residuos de la supuesta proteína asociada del extremo N-terminal. Las simulaciones de acoplamiento de péptidos identificaron varios residuos putativos que son clave para la especificidad del sistema entre una ATPasa A/D y su proteína asociada (datos complementarios 3, pestaña 3).

Finalmente, realizamos una mutagénesis de escaneo de alanina in silico en todos los residuos que comprenden la interfaz de interacción de los péptidos N-terminales de las proteínas asociadas acopladas en su ATPasa A / D afín (Datos complementarios 3, Pestaña 4). Los valores de ΔΔG resultantes identifican la medida en que cada residuo contribuye a la estabilidad de la interacción de la proteína asociada con su ATPasa A/D afín. Es importante destacar que nuestras simulaciones de sustitución de alanina in silico identificaron todos los residuos experimentalmente demostrados como importantes para acoplar el péptido MinE de Escherichia coli en el dímero MinD47,50,51 (Fig. 7c complementaria). Juntos, nuestros datos in silico proporcionan una hoja de ruta para la mutagénesis estratégica y el sondeo mecánico de los determinantes de especificidad involucrados en la segregación de cromosomas bacterianos, el posicionamiento de la división celular y el tráfico de orgánulos basados ​​en proteínas por ATPasas A/D en procariotas.

El estudio de las ATPasas A/D se ha centrado en una carga específica de un determinado proceso biológico y, en gran medida, en organismos modelo que codifican solo una o dos ATPasas A/D. En estos estudios, normalmente se plantean dos preguntas: ¿Cómo encuentra una carga específica su posición correcta y cómo cambia esta posición con el tiempo? Aquí, nuestro enfoque estaba en los sistemas de posicionamiento, en lugar de un tipo de carga o proceso biológico específico. Por lo tanto, nuestro enfoque de biología de sistemas aborda cómo múltiples A/D ATPasas coordinan el posicionamiento de diversas cargas en la misma celda.

La codificación de múltiples ATPasas A/D es una característica compartida entre los procariotas. Encontramos que más de un tercio de todos los genomas bacterianos secuenciados codifican múltiples ATPasas A / D (Fig. 1a), con algunas bacterias codificando> 10. Curiosamente, aunque la mayoría de las bacterias tienen las mismas cargas fundamentales, no todas utilizan sistemas de posicionamiento basados ​​en A/D dedicados. Por ejemplo, muchas de las cargas celulares que encontramos aquí están posicionadas por ATPasas A/D en ciertas bacterias, como H. neapolitanus, no están posicionadas activamente por ATPasas A/D en otras, como E. coli. Lo que requiere una ATPasa A/D para colocar una determinada carga celular en una bacteria y no en otra sigue siendo una pregunta abierta. Sin embargo, parece haber un límite en el número de ATPasas A/D que puede codificar una bacteria. Las ATPasas A/D también están codificadas en genomas de arqueas52, pero se sabe poco sobre sus funciones en la organización subcelular. Un estudio reciente mostró que las especies de arqueas en varios filos, Euryarchaeota en particular, codifican múltiples ATPasas A/D53. Varias de estas especies contenían más de una docena, incluida H. volcanii con 13 A/D ATPasas, cuatro de las cuales son homólogos de MinD. Sorprendentemente, los cuatro homólogos de MinD no fueron necesarios para el posicionamiento de la división celular, pero uno (MinD4) estimuló la formación de matrices de quimiotaxis y archaella, que es el equivalente funcional del flagelo bacteriano. Este estudio enfatiza la importancia de vincular experimentalmente ATPasas A/D a sus cargas celulares como lo hemos hecho aquí.

La familia de ATPasas ParA/MinD regula espaciotemporalmente una lista creciente de diversos complejos de mesoescala críticos para procesos fundamentales en procariotas, incluidos el crecimiento y la división celular, la segregación del ADN, la motilidad, la conjugación y la patogénesis20,21. Por lo tanto, comprender cómo las ATPasas A/D coordinan el posicionamiento de las cargas celulares en la ubicación correcta en el momento correcto es clave para comprender la función de las células bacterianas. Usando H. neapolitanus como modelo no patógeno, nuestros hallazgos respaldan firmemente la idea de que cada ATPasa está dedicada al posicionamiento de una carga celular específica. Nuestro modelo también reveló la dependencia del tráfico de orgánulos basado en proteínas en la fiel replicación y segregación del cromosoma, así como en el posicionamiento de la división celular en la mitad de la célula. Por ejemplo, mientras que la consecuencia directa de eliminar ParA fue la mala segregación cromosómica, la herencia cromosómica asimétrica resultante también condujo a defectos indirectos en el posicionamiento de los grupos de carboxisomas y quimiotaxis. También identificamos una relación epistática previamente no caracterizada en el posicionamiento de flagelos por FlhG y su influencia aguas abajo en la regulación espacial del grupo de quimiotaxis por ParC. Es bien sabido que los grupos de quimiotaxis dirigen la motilidad celular controlando la dirección de rotación flagelar. Sin embargo, hasta donde sabemos, aún no se ha documentado la diafonía en la regulación espacial de flagelos y grupos de quimiotaxis. Los estudios futuros determinarán los actores moleculares involucrados en la diafonía entre el posicionamiento basado en A/D de estas dos cargas celulares, ambas involucradas en la motilidad celular.

Nuestra bioinformática también identificó una sexta A/D ATPasa en el genoma de H. neapolitanus. Hn1669 es una ATPasa A/D que muestra homología con VirC1 y se encuentra cerca de los genes trb, que codifican componentes de la maquinaria de conjugación (Fig. 1b). Un único estudio ha demostrado que la ATPasa VirC1, codificada en el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, participa en el reclutamiento del plásmido Ti conjugativo para la máquina de secreción de tipo IV en los polos celulares10. Curiosamente, en H. neapolitanus, el homólogo de VirC1 está codificado en un elemento conjugativo integrador (ICE) y el gen corriente abajo de esta ATPasa A/D codifica un homólogo de ParB. Los ICE son los principales impulsores de la evolución bacteriana y la propagación de genes de resistencia a los antibióticos54. Todavía tenemos que visualizar la conjugación en H. neapolitanus, pero sospechamos que este homólogo de ParB se une y delimita el locus ICE durante la conjugación. Es atractivo especular que el homólogo VirC1 y su homólogo ParB aguas abajo están involucrados en el transporte y posicionamiento del locus ICE en la máquina de secreción Tipo IV en el polo celular para la conjugación.

Si bien las ATPasas A/D comparten similitudes bioquímicas, estructurales y de secuencia, las proteínas asociadas que vinculan estas ATPasas con sus cargas son extremadamente diversas. Debido a esta diversidad, no siempre se ha identificado la proteína asociada y, como resultado, muchas ATPasas A/D se denominan "huérfanas"20. La extrema diversidad se debe en gran medida a las proteínas asociadas que proporcionan los determinantes de especificidad que vinculan una ATPasa A/D con su carga afín. A pesar de su extrema diversidad, los datos en todo el campo respaldan la idea de que las proteínas asociadas interactúan y estimulan sus ATPasas A/D a través de un mecanismo compartido. Se ha demostrado o sugerido que las proteínas asociadas involucradas en la partición de plásmidos y la segregación cromosómica, así como las requeridas para posicionar BMC, flagelos, grupos de quimiotaxis y el divisoma, interactúan con su ATPasa A/D a través de una N desordenada y cargada positivamente. -terminal49. Nuestro análisis in silico de dímeros A/D ATPasa acoplados con péptidos N-terminales de sus proteínas asociadas demuestra cómo se asignan cargos específicos y cómo estos sistemas de posicionamiento relacionados coexisten y funcionan en la misma célula sin interferencia cruzada.

En el futuro, nuestro objetivo es utilizar H. neapolitanus como modelo para definir el modo general de transporte compartido entre toda la familia A/D ATPasa y determinar cómo se alteran las reacciones de posicionamiento para cargas dispares. Estos hallazgos son significativos porque las ATPasas A/D organizan espacialmente esencialmente todos los aspectos de la función de las células bacterianas. Una dirección futura adicional es verificar experimentalmente los determinantes de especificidad que identificamos aquí para cada carga y proteína asociada, y aprovechar este conocimiento en el diseño racional de sistemas de posicionamiento en bacterias. Se espera que estas contribuciones sean significativas porque los sistemas mínimos de autoorganización son herramientas vitales para la biología sintética55. Nuestro objetivo es diseñar sistemas de posicionamiento autónomo mínimo (MAPS) que consisten en una ATPasa de posicionamiento y su péptido N-terminal de proteína asociada como una "etiqueta de equipaje" para ser utilizada como reguladores espaciales para cargas naturales y sintéticas en bacterias heterólogas.

El análisis tBLASTn se realizó utilizando una secuencia de consenso ParA/MinD (xKGGxxK[T/S]), como una consulta contra la base de datos de genomas representativos RefSeq con secuencias objetivo máximas como 5000 y umbral de valor E en 0,0001. Las secuencias se filtraron para aquellas que compartían la homología de secuencia y tenían uno de los genes de carga putativos identificados, confirmado mediante webFlaGs (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32956448/). La consulta de consenso se generó mediante COBOLT (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17332019/).

Se seleccionaron algunos genomas representativos para mostrar la conservación de la vecindad de genes. La identificación de los orígenes de replicación (OriC) se realizó utilizando Ori-Finder (https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-9-79). La figura del análisis FlaGs se generó utilizando Gene Graphics (https://katlabs.cc/genegraphics/).

Las secuencias se alinearon usando Clustal Omega. El árbol resultante se importó a iTOL para generar un árbol sin raíces. (Números de acceso del NCBI: Hn2335—ACX97145.1; Hn1364—ACX96198.1; Hn0912—ACX95755.1; Hn0716—ACX95565.1; Hn0722—ACX95571.1; Hn1669—ACX96495.1; Hn0255—ACX9511 8.1).

Todos los mutantes descritos en este estudio se construyeron usando WT Halothiobacillus neapolitanus (Parker) Kelly and Wood (ATCC® 23641™) adquirido de ATCC. Los cultivos se cultivaron en ATCC® Medium 290: S-6 medium for Thiobacilli (Hutchinson et al., 1965) y se incubaron a 30 °C, mientras se agitaban a 130 RPM en aire suplementado con 5 % de CO2. Las cepas se conservaron congeladas a -80 °C en DMSO al 10 %.

Todas las construcciones se generaron utilizando Gibson Assembly y se verificaron mediante secuenciación. Los fragmentos para ensamblar se sintetizaron por PCR o se ordenaron como gBlock (IDT). Las construcciones contenían ADN flanqueante que oscilaba entre 750 y 1100 pb de longitud aguas arriba y aguas abajo del sitio de inserción objetivo para promover la recombinación homóloga en los loci genómicos objetivo. La clonación de plásmidos se realizó en células E. coli Top10 o Stellar químicamente competentes (Takara Bio).

Se generaron células competentes de H. neapolitanus como se informó anteriormente. En resumen, se cultivó 1 L de cultivo a una DO de 0,1 a 0,15. Los cultivos se recogieron por centrifugación a 5000 x g durante 20 min a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron y se lavaron dos veces con 0,5 volúmenes de agua de nanoporos helada. Todos los pasos de centrifugación de lavado se realizaron a 3000xg durante 30 min a 4 °C. El sedimento resultante después del lavado se resuspendió en 1 × 10-3 volúmenes de agua de nanoporos helada. Estas células competentes se usaron inmediatamente o se congelaron a -80 °C para uso futuro. Las células competentes congeladas se descongelaron a 4 °C antes de su uso.

Se mezclaron 50-100 µL de células competentes con 5 µL de ADN plasmídico (1–5 µg) y se incubaron en hielo durante 5 min. Luego, esta mezcla se transfirió a un tubo que contenía 5 ml de medio S6 helado sin antibióticos y se incubó en hielo durante 5 min. Las transformaciones se recuperaron durante 16–36 h, mientras se agitaban a 130 RPM, a 30 °C, en aire suplementado con 5 % de CO2. Los clones se seleccionaron sembrando en medio selectivo con antibióticos. Las colonias fueron renovadas. Se verificó la mutación de las colonias resecadas mediante PCR.

Para la fusión fluorescente nativa de ParB-mNG, mNG-FliN y CheY-mNG, la secuencia que codifica la proteína fluorescente mNeonGreen (mNG) se unió a la región 3' o 5' de las secuencias codificantes nativas, separadas por un conector GSGSGS. . Para la fusión fluorescente nativa de Cbbs-mTQ, la secuencia que codifica la proteína fluorescente mTurquoise (mTQ) se unió a la región 3' de la secuencia codificante nativa, separada por un conector GSGSGS. Se insertó un casete de resistencia a la kanamicina antes del gen para las etiquetas N-terminales o después del gen para las etiquetas C-terminales. Cuando fue necesario, se duplicó el promotor. El mutante se seleccionó sembrando en placas de agar S6 complementadas con 50 μg/mL de kanamicina. Todas las fusiones fueron verificadas por PCR.

Para las deleciones de Hn2335, Hn1364, Hn0912 y Hn0722, los genes se reemplazaron con un casete de resistencia a la espectinomicina, seguido de un promotor duplicado para el gen corriente abajo. La deleción de Hn0716 se obtuvo optimizando los codones del gen corriente abajo e insertando el casete de resistencia a la espectinomicina después de este gen optimizado por codones. Los mutantes se seleccionaron sembrando en placas de agar S6 complementadas con 50 μg/mL de espectinomicina. Todas las mutaciones fueron verificadas por PCR.

Los genes eliminados (Hn2335, Hn1364, Hn0912, Hn0716 y Hn0722) se colocaron individualmente bajo la expresión de un promotor Ptrc y se insertaron en un sitio neutral, ubicado entre los genes Hn0933 y Hn0934. Los mutantes se seleccionaron sembrando en placas de agar S6 complementadas con 25 µg/mL de cloranfenicol. La inserción se verificó por PCR. Para la obtención de imágenes, las células se cultivaron hasta una DO de 0,1, se indujeron con IPTG 0, 0,25, 1, 5, 10 y/o 50 µM durante un máximo de 6 h y se tomaron imágenes para la complementación en varios puntos temporales. Hn2335 complementado con IPTG 50 µM durante 3 h. Hn1364 complementado con IPTG 50 µM durante 6 h. Hn0716 complementado con la expresión con fugas del promotor de Ptrc y la inducción no fue necesaria. Hn0912 y Hn0722 no se complementaron solo con esos genes. Para estos dos mutantes, se hicieron construcciones adicionales para incluir los genes superpuestos vecinos: Hn0911-Hn0912 y Hn0722-Hn0723. Los constructos se generaron, verificaron, indujeron y obtuvieron imágenes como se detalla anteriormente. Hn0911-Hn0912 complementado con IPTG 50 µM durante 3 h. Hn0722-Hn0723 complementado con IPTG 50 µM durante 3 h.

Toda la microscopía de células vivas se realizó utilizando células en crecimiento exponencial. Se colocaron 3-5 µL de células en una pieza de agarosa UltraPure al 2 % (Invitrogen, número de catálogo 16500) + almohadilla S6 y se tomaron imágenes en un plato con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek, número de catálogo P35G-1.5-14-C) . Todas las imágenes de fluorescencia y contraste de fase se realizaron utilizando un microscopio invertido motorizado Nikon Ti2-E controlado por el software NIS Elements con una fuente de luz LED SOLA 365, una lente de objetivo 100X (Oil CFI Plan Apochromat DM Lambda Series para contraste de fase) y un Photometrics Cámara sCMOS retroiluminada Prime 95B o una cámara Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT + sCMOS. Se tomaron imágenes de ParB-mNG, mNG-FliN y CheY-mNG usando un conjunto de filtros "GFP" (C-FL GFP, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation: 470/40 nm [450-490 nm], Emisión: 525/50 nm [500-550 nm], Espejo dicroico: 495 nm). Se tomaron imágenes de carboxisomas marcados con CbbS-mTQ utilizando un conjunto de filtros "CFP" (C-FL CFP, capa dura, alta relación señal-ruido, cambio cero, excitación: 436/20 nm [426-446 nm], emisión: 480/ 40 nm [460-500 nm], espejo dicroico: 455 nm). Se tomaron imágenes de fluorescencia DAPI utilizando un conjunto de filtros "DAPI" estándar (C-FL DAPI, capa dura, alta relación señal-ruido, cambio cero, excitación: 350/50 nm [325-375 nm], emisión: 460/50 nm [435-485 nm], Espejo dicroico: 400 nm). Se tomaron imágenes de flagelos conjugados con maleimida Alexa Fluor 594 C5 utilizando un conjunto de filtros "TexasRed" (C-FL Texas Red, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation: 560/40 nm [540-580 nm], Emisión: 630/75 nm [593-668 nm], Espejo dicroico: 585 nm).

Para la microscopía de lapso de tiempo multigeneracional, se colaron agarosa UltraPure al 1,5 % (Invitrogen, número de catálogo 16500) + almohadillas S6 en placas con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek, número de catálogo P35G-1.5-14-C). Las placas se preincubaron a 30 °C en CO2 al 5 % durante al menos 24 h. Se colocaron 4 µl de células en crecimiento exponencial sobre la almohadilla de agar. Las concentraciones de temperatura, humedad y CO2 se controlaron con un sistema de incubación Tokai Hit. Se utilizó el software NIS Elements para la adquisición de imágenes. Las células se preincubaron en la parte superior del escenario durante al menos 30 minutos antes de la adquisición de imágenes. Los videos se tomaron en un marco por 2,5 a 5 minutos durante una duración de 12 a 24 horas.

Se capturaron varios campos de visión para cada mutante. Todos los canales de fluorescencia se sometieron a sustracción de fondo en Fiji con un radio de bola rodante de 50 μm. Las imágenes de fluorescencia sustraídas de fondo se fusionaron con imágenes de contraste de fase para crear compuestos utilizados para el análisis de imágenes. El análisis de imágenes, incluida la identificación de células, la cuantificación de la longitud de las células, la localización de los focos, el número de focos, la intensidad de la fluorescencia de los focos y la identificación de los sitios de constricción, se realizaron con el complemento de Fiji MicrobeJ 5.13I56,57. La detección y segmentación del perímetro de la celda se realizaron utilizando el descriptor en forma de barra con una configuración de umbral predeterminada en una tolerancia de 56. Los parámetros de detección máxima se establecieron individualmente para cada carga. Para la detección de focos ParB-mNG (carga = cromosoma), la tolerancia y la puntuación z se establecieron en 100. Para la detección de focos CheY-mNG (carga = quimiotaxis), la tolerancia se estableció en 150 y la puntuación z en 100. Para Detección de focos mNG-FliN (carga = flagelos), la tolerancia se estableció en 710 y la puntuación z se estableció en 69. Para la detección de focos CbbS-mTQ (carga = carboxisoma), se utilizó la detección puntual en lugar de la detección de focos, y se estableció la tolerancia a 1010. Los resultados se verificaron manualmente con el editor de experimentos y las células no segmentadas se cortaron con un cortador de partículas. Se registraron asociaciones, descriptores de forma, perfiles y localización para cada cepa. Los gráficos de localización se generaron automáticamente a través de MicrobeJ. Los gráficos de intensidad de fluorescencia y los gráficos de recuento de focos se realizaron en GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, www.graphpad.com).

Las células se recogieron por centrifugación a 5000 g durante 5 min. Después de la centrifugación, las células se lavaron en PBS, pH 7,4. El sedimento celular resultante se resuspendió en 100 μl de PBS y se tiñó con SytoxBlue (Invitrogen, número de catálogo S34862) a una concentración final de 500 nM. Las muestras se incubaron en la oscuridad, a temperatura ambiente durante 5-10 min. Las células teñidas se cargaron directamente en una almohadilla de agar S6 que se había infundido con SytoxBlue 500 nM.

Se capturaron once fotogramas en el transcurso de 2 min. Los carboxisomas se contaron en cada marco. El número más alto contado por célula se utilizó para el recuento de carboxisomas.

Los ensayos de motilidad se realizaron en S6 en agar al 0,4 %. Las células se cultivaron en una placa de medio S6. Las colonias individuales se inocularon en tubos o placas de medios de motilidad y se incubaron a 30 °C en aire suplementado con 5 % de CO2. La motilidad de los tubos y las placas se comprobó diariamente durante 2 semanas.

La flagelina de H. neapolitanus se identificó utilizando una búsqueda de homología BLAST con Hag de Bacillus subtilis como consulta. Solo se encontró un único gen de flagelina. Se consideraron varios residuos de treonina y serina para la mutagénesis de cisteína. Los residuos se mutaron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (NEB, E0554S). Se verificó la mutación de cisteína en los clones mediante secuenciación.

El tinte de maleimida Alexa Fluor 594 C5 (Invitrogen, A10256) se resuspendió en DMSO a la concentración de trabajo de 10 mM. Los cultivos de H. neapolitanus se cultivaron hasta una DO de 0,1–0,2. Los cultivos se ajustaron a un pH de 7,0 utilizando PBS, pH 11,7. A continuación, las células a un pH ajustado de 7,0 se tiñeron con colorante de maleimida Alexa Fluor 594 C5 a una concentración de colorante final de 100 µM. Los cultivos de tinción se incubaron durante la noche a 4 °C. Las células teñidas se lavaron 4+ veces en PBS, pH 7,4. Todos los pasos de centrifugación se realizaron a 5000 × g durante 3 min.

Para los análisis de toda la población, como la intensidad de la fluorescencia y las mediciones de la longitud de las células, realizamos una prueba no paramétrica de Wilcoxon (Kruskal-Wallis) seguida de una prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Para los análisis de porcentaje de población, como el número de focos o la presencia de sitios de constricción en la mitad de la celda, las poblaciones se analizaron como campos de visión separados y los valores de resumen se trazaron como puntos de datos separados. Luego realizamos una prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch seguida de la prueba de comparaciones múltiples T3 de Dunnett. Se utilizó GraphPad Prism (versión 9.5.1) para realizar todos los análisis. Estilo de valor p: 0,1234 (ns), 0,0332 (*), 0,0021 (**), 0,0002 (***), < 0,0001 (****).

Las películas se recortaron usando Fiji. Las películas se estabilizaron con el complemento de alineación HyperStack multicanal llamado HyperStackReg. Las anotaciones de marca de tiempo y barra de escala se agregaron usando Fiji. Se agregaron flechas y pausas usando Adobe Premier Pro.

Para MinD y McdA, generamos los modelos de acoplamiento de péptido-ATPasa N-terminal utilizando la implementación CollabFold de AlphaFold258,59. Los péptidos N-terminales se definieron como los primeros 30 residuos de la supuesta proteína asociada del N-terminal. Se construyeron alineaciones de secuencias múltiples utilizando MMseqs2. Para cada par de péptido-ATPasa, generamos cinco estructuras con los hiperparámetros CollabFold/AlphaFold2 predeterminados guardados para aumentar a 12 el número de reciclados para cada modelo. Como predeterminado para Alphafold2, las estructuras se minimizaron energéticamente con AMBER usando el campo de fuerza Amber99sb. Seleccionamos modelos de péptidos acoplados en función de las puntuaciones de pLDDT de los residuos de la interfaz de unión y la similitud con las estructuras cristalinas de ATPasa/proteína asociada similares a ParA previamente resueltas.

Para ParA, FlhG y ParC, generamos modelos de péptidos acoplados utilizando el protocolo FlexPepDock de Rosetta60. En primer lugar, equilibramos las estructuras de homodímero de ATPasa generadas a partir de AlphaFold2 con el campo de fuerza ref2015_cart_cst Rosetta con el protocolo de refinamiento de átomo completo FastRelax con minimización del espacio de coordenadas cartesianas utilizando el minimizador lbfgs_armijo_nonmonotone. Para preservar la posición de los átomos de la columna vertebral predicha por AlphaFold2, se agregó una restricción de coordenadas del átomo de la columna vertebral. Para este paso inicial, generamos 20 trayectorias con la estructura de puntuación más baja utilizada para el paso de acoplamiento de péptidos. Usamos score3 con los campos de fuerza docking_cen.wts_patch y REF2015 para los pasos de acoplamiento de baja y alta resolución del protocolo FlexPepDock, respectivamente. Para cada par proteína asociada putativa/ATPasa, simulamos 50 000 trayectorias de acoplamiento. Las dos mil trayectorias superiores definidas por las energías más bajas se agruparon luego utilizando Calibur61. Luego, elegimos los modelos finales en función de la información del clúster, la energía y la plausibilidad mecanicista. A partir de los modelos acoplados finales elegidos de las simulaciones de Rosetta y Alphafold2, buscamos identificar residuos de unión clave a través de un escaneo de mutación de alanina in-silico y cálculos de ΔΔG. Mutamos iterativamente todos los residuos de la interfaz del péptido acoplado y calculamos el ΔΔG usando el protocolo FlexDDG en Rosetta con talaris2014 forcefield62. En FlexDDG, para cada mutación, las conformaciones de la cadena principal y lateral se muestrearon 35.000 veces utilizando el método de frotamiento de Monte Carlo de Rosetta. En cada intervalo de 2500 muestras se calculó el ΔΔG de mutación. El ΔΔG informado final es el promedio de 35 trayectorias de este tipo.

(Números de acceso de NCBI: proteína asociada de ParA (ParB)—ACX97144.1; proteína asociada de MinD (MinE)—ACX96199.1; proteína asociada de McdA (McdB)—ACX95754.1; proteína asociada de FlhG (FliA)—ACX95566.1; ParC proteína asociada (CheW)—ACX95572.1). Los primeros 30 aminoácidos del extremo N de cada proteína asociada se acoplaron a las estructuras de dímero in silico utilizando AlphaFold2 (MinD, McdA) o Rosetta (ParA, FlhG, ParC). La interfase de unión fue definida por aquellos residuos que compartían un mínimo de 1 Angstrom2 de área superficial.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Genomas bacterianos obtenidos de NCBI RefSeq DataBase (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). Estructuras de ATPasa ParA/MinD determinadas experimentalmente obtenidas del Protein Data Bank (PDB): ParA (5U1G); McdA (6 NOP); ParC (5U1G); MinD (3Q9L); FlhG (4RZ3). Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Los datos fuente también se proporcionan con este documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Los datos fuente también se proporcionan con este documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código generado durante este estudio está disponible en GitHub:Identificación de ATPasas ParA/MinD en bacterias usando BLAST (https://github.com/krthkkrv/Multiple-ParA-MinD-ATPases-coordinate-the-positioning-of-disparate-cargos -in-a-bacterial-cell)63, Identificación de determinantes de especificidad de cada ParA/MinD ATPasa en H. neapolitanus utilizando AlphaFold2 y Rosetta (https://github.com/jilimcaoco/Multiple-ParA-MinD-ATPases)64.

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Agradecemos a Joshua S. MacCready, Christopher A. Azaldegui, Joseph L. Basalla, Ajai J. Pulianmackal y Claudia Mak por sus interesantes debates. Damos las gracias a Holly Turula y Miles Mckenna por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Premio de la Fundación Nacional de Ciencias No. 1817478 (AGV), el Programa de Becas de Investigación para Graduados de la Fundación Nacional de Ciencias DGE 1841052 (LTP) y de fondos de iniciación de investigación proporcionados por el Departamento MCDB (AGV).

Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, EE. UU.

Lisa T. Pulianmackal

Departamento de Medicina Computacional y Bioinformática, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, EE. UU.

José Miguel I. Limcaoco & Matthew J. O'Meara

Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, EE. UU.

Keerthikka Ravi, Sinyu Yang, Jeffrey Zhang, Mimi K. Tran, Maria Ghalmi y Anthony G. Vecchiarelli

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Conceptualización, LTP y AGV; Metodología, LTP, MJL, KR; Análisis Formal, LTPMJL, KR, SY, MG, MJO y AGV; Investigación, LTP, JZ y MKT; Recursos, AGV; Redacción—Borrador original, LTP y AGV; Visualización, LTP, JMIL, KR y AGV; Supervisión, LTP, MJO y AGV; Adquisición de Financiamiento, LTP y AGV

Correspondencia a Anthony G. Vecchiarelli.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Kai Thormann y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Pulianmackal, LT, Limcaoco, JMI, Ravi, K. et al. Múltiples ATPasas ParA/MinD coordinan el posicionamiento de cargas dispares en una célula bacteriana. Nat Comun 14, 3255 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39019-x

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Recibido: 12 enero 2023

Aceptado: 22 de mayo de 2023

Publicado: 05 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39019-x

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